成功案例
抗肿瘤的人源化单克隆抗体重组KP抗体的生产工艺及产品开发研究
发表时间:2013-12-09 阅读次数:1849次

抗肿瘤的人源化单克隆抗体重组KP抗体目前基本完成临床前的研究,包括工艺培养、蛋白纯化、质量分析和初步的药效、药代动力学研究。

 

前期开发数据:

图 1高表达细胞株摇瓶培养生长曲线与蛋白表达

图 2 KP蛋白SDS-PAGE检测结果

 

图 1和图 2表明,KP细胞株在摇瓶内生长状况良好,在未优化培养基与生产条件下表达量超过1.2g/L.纯化KP蛋白轻链分子量约25KD,重链分子量约50KD,全分子量约150KD,与抗体对照品分子量相附。

 

生产工艺:

a.反应器细胞生长曲线

图 3 7L反应器Perfusion细胞生长曲线

b.细胞代谢及生产曲线

图 4 7L反应器Perfusion细胞代谢与生长曲线

c.纯化数据:抗体SEC-HPLC纯度达到100%

图 5 KP抗体SEC-HPLC纯度分析结果

KP细胞在7L反应器中葡萄糖浓度未定后维持在1g/L左右,乳酸值维持在2g/L左右,KP蛋白表达量在灌注的第2天即达到0.2g/L,最高值可达到0.6g/L,单位体积表达量稳定后维持在0.45g/L/day以上。

KP蛋白经过Protein A亲和层析和Capto Adhere填料纯化后内毒素、宿主蛋白、残余DNA指标均达到国内申报标准,经过分子筛的HPLC分析,纯度达到100%。

 

蛋白质量研究:

A.生物仿制药与原研药结构对比

肽图:

图 6 KP仿制药与原研药肽图比对

高分辨质谱分子量对比:

表1 KP抗体高分辨质谱检测分子量结果

 

(1)KP蛋白的轻链分子量与理论值完全一致,结合KP蛋白和原研药测序结果可判断,KP蛋白的轻链蛋白以及结构应与原研药一致。

(2)KP蛋白重链切糖后的分子量实测值49327Da,而理论序列的分子量值为49472.06Da,二者差值约为145Da。考虑重链N端谷氨酰胺(Q)环化使原谷氨酰胺分子量减少17Da,重链C端赖氨酸(K)缺失使分子量减少128Da,重链分子量理论值变化约为:49472Da-17Da-128Da = 49327Da,与实测值相同。

综合以上数据及KP蛋白和原研药测序结果可判断,KP重链一级结构与原研药一致,且发生了末端Q环化和K缺失。

表2 三批样品与原研药高分辨质谱分子量对比

 

表2数据表明,三批KP样品与两批原研药药品的全分子分子量高度一致,且三个主峰的分子量结果均保持一致。由此可得出结论:

(1)KP蛋白与原研药具有高度相似的糖型

(2)KP蛋白与原研药具有高度相似的糖基化修饰水平

KP蛋白与原研药批次间的糖基化修饰水平具有高度一致性,表明KP蛋白工艺相对稳定。

图 7 KP与原研药糖型对比

根据糖型分析可得出以下结论:1)KP蛋白与原研药具有高度相似的糖基化饰水平;2)二者糖型类型高度一致,主要为岩藻糖化寡糖核心的二分支型结构糖型;3)二者各主要糖型比例高度相似。

 

药效学与药代动力学研究:

图 8 KP仿制药与原研药大鼠模型药效学研究

图 9 KP仿制药与原研药食蟹猴药代动力学对比

药效学与药代动力学试验表明,KP蛋白与原研药具有相似的药效学与药代动力学特性。在药代动力学试验过程中食蟹猴并未发生明显不良反应,初步表明KP蛋白具有良好的安全性。

 

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